正文

酵母双杂交原理（酵母双杂交原理简述）

追马博客
追马博客 V管理员 /298阅读/0评论
1231

本篇文章给大家谈谈酵母双杂交原理，以及酵母双杂交原理简述对应的知识点，希望对各位有所帮助，不要忘了收藏本站喔。

本文目录一览：

十万火急！！！！十万火急！！谁能告诉我GST-PULLDOWN的原理以及酵母杂交技术的原理哈？？？？？？

GST亲和层析和GST Pull-down方法

此方法的基本原理是：利用重组技术将探针蛋

白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋

白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）

亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白

通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸

附而分离。在病毒受体研究中，融合蛋白通常设计

为病毒吸附蛋白（VAP）。这方面成功的例子有

HBV[28]。具体做法如下：将GST-融合探针蛋白

（VAP）和GTH-Sepharose制成亲和层析柱，然后待

分析的蛋白质混合液流经亲和层析柱，梯度洗脱，

分离、收集各蛋白组分，这称为GST亲和柱层析

（GST affinity column chromatography）。如果一开

始待检蛋白就和GST- 融合探针蛋白与

GTH-Sepharose一起共同孵育，经离心收集洗脱复

合物和洗涤后，再加入过量GTH获得相互作用蛋白

的复合物，那么这种方法则称为GST pull down。

GST亲和层析及相应的GST Pull-down方法的

优点是敏感，对混合物中的所有蛋白均“一视同仁”，

也可用于受体功能的鉴定。缺点是GST有可能影响

融合蛋白的空间结构，另外，蛋白质浓度对实验也

有一定影响。

3.6 酵母双杂交技术

许多真核生物的转录激活因子通常具有两个

可独立存在的结构域，即DNA结合域（BD）与转

录激活域（AD）。这两个结构域各具功能，互不影

响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必

须同时含有这两个结构域。不同来源的激活因子的

BD区与AD结合后则可特异地激活被BD结合的基

因表达。基于这个原理，人们将两个待测蛋白分别

与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个

酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用

就会使AD与BD形成完整的转录激活因子并激活相

应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用.

酵母双杂交系统由三个部分组成：①与BD融合

的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；

②AD融合的蛋白表达载体，其表达的蛋白称靶蛋

白（prey）；③带有一个或多个报告基因的宿主菌株。

常用的报告基因有HIS3、URA3、LacZ和ADE2等。

而菌株则具有相应的营养缺陷型。

双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营

养标记基因，有利于杂交质粒的鉴定与分离。根据

目前通用系统中BD来源主要分为GAL4系统和

LexA系统。后者因BD来源于原核生物，在真核生

物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

近年来，开始出现了应用酵母双杂交技术进行

病毒受体研究的成功报告，如麻疹病毒的绒猴细胞

受体[30]。李凌云等构建了表达“猎物”（prey）蛋白

的质粒和表达病毒VAP“诱饵”（bait）蛋白的质粒，

然后共转染同一酵母细胞，利用已建立的易感细胞

cDNA文库，筛到了阳性克隆。

酵母双杂交技术的优点是灵敏度高，特异性较

好，缺点是容易出现假阳性和假阴性，而且对蛋白

质在细胞中的定位有要求。

为了克服上述缺点，人们进一步优化出所谓“双

筛选系统”，即蛋白质相互作用必须同时激活两个

以上报道基因，具有两种以上的相应表型才算是真

的阳性结果。另外，人们也改造了酵母双杂交系统

所用的载体系统，将在细胞浆内发生的蛋白质相互

作用转移到细胞膜上进行，以此来更容易地筛选膜

蛋白受体，如Ras recruitment system（RRS）。

酵母双杂交原理（酵母双杂交原理简述） 酵母双杂交原理 第1张

酵母双杂交实验操作步骤大全的信息你有吗？

最近在做龙须菜高温胁迫表达cDNA文库的构建，选择的是CaM做诱饵质粒构建表达载体pGBKT-CaM，利用SMART技术将重组质粒转化到酵母菌Y187中，搜集了部分资料找到了一份比较全的酵母双杂交实验操作步骤。

一.酵母双杂交系统的原理

酵母的转录激活因子GAL4由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成，N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。BD可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而AD则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的BD或AD不能激活基因转录，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。酵母双杂交系统主要利用酵母的GAL4的这个特性通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因敏感地检测到。酵母双杂交技术不仅应用于哺乳动物蛋白质之间的相互作用研究，还可以用来研究高等植物蛋白质之间的相互作用。

……

详细资料请参考：on

酵母双杂交原理及步骤

酵母双杂交系统

真核生物转录调控因子具有组件式结构 (modular) 特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域， 其中DNA结合结构域( binding domain， BD)和转录激活结构域( activation domain， AD)是转录激活因子发挥功能所必须的。

BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由.不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使.激活转录的功能。

co-ipchip和酵母双杂交原理有什么区别

区别如下：

酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核 生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个 DNA 特异性结合功 能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用

酵母双杂交技术原理

酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生物转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域： DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。

中文名

酵母双杂交系统原理

类型

系统原理

如

GAL4

英文

DNA-activating domain

快速

导航

优点应用

二类载体

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。

优点

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。

最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:

〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。

〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。

〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。

一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。

激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。

应用

酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。

主要是由于：

①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。

②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行， 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。

③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合， 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。

④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。 同时， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。

酵母双杂交和荧光共振能量转移技术的异同点

作用相同，原理不同。

1、相同点：酵母双杂交技术和荧光共振能量转移技术都能够用于分析蛋白质分子间是否相互作用。

2、不同点：酵母双杂交技术原理是酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。荧光共振能量转移技术的原理是采用物理方法去检测分子间的相互作用。

酵母双杂交原理的介绍就聊到这里吧，感谢你花时间阅读本站内容，更多关于酵母双杂交原理简述、酵母双杂交原理的信息别忘了在本站进行查找喔。